提起光合作用測(cè)量?jī)x器，
可能很多人都會(huì)搶答，
這個(gè)我知道，光合儀和熒光儀嘛！
那我再問(wèn)，光合儀和熒光儀具體都測(cè)什么？
如何選擇？哪個(gè)更好用？
突然好多概念，參數(shù)浮現(xiàn)在腦海，
我們好像在哪見過(guò)！
OK！坐好，手背后邊，
睜大眼睛，豎起耳朵，
聽小編來(lái)給你們“瞎扯”一番。
—— 光合作用的光&合 ——
Photosynthesis=Photon（光）+Synthesis（合），光合作用可分為光反應(yīng)和暗反應(yīng)。
光反應(yīng)：發(fā)生葉綠體的類囊體膜上，以光能捕獲傳遞轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的光能利用，氧氣釋放和電子傳遞。
暗反應(yīng)：發(fā)生在葉綠體基質(zhì)內(nèi)，以CO2吸收同化合成為基礎(chǔ)的酶促反應(yīng)，羧化，還原，再生。
>> 總結(jié) <<
光反應(yīng)：反應(yīng)相對(duì)快，光子轉(zhuǎn)化成電子實(shí)現(xiàn)太陽(yáng)能的初級(jí)利用。涉及到光能轉(zhuǎn)換效率，激發(fā)能耗散途徑，電子傳遞速率，NADPH和ATP合成。
暗反應(yīng)：反應(yīng)相對(duì)慢，吸收CO2，通過(guò)酶促反應(yīng)利用光反應(yīng)產(chǎn)生的還原劑，合成糖類，淀粉，實(shí)現(xiàn)活躍化學(xué)能到穩(wěn)定化學(xué)能的轉(zhuǎn)化。涉及氣孔導(dǎo)度，葉肉導(dǎo)度，蒸騰速率，羧化效率。
—— 光反應(yīng)和暗反應(yīng)的測(cè)量?jī)x器 ——
光合儀：氣體交換原理，利用紅外氣體分析器（InfraRed Gas Analyzer IRGA）測(cè)量流經(jīng)葉片前后CO2和H2O的濃度變化，分析葉片與環(huán)境發(fā)生的氣體交換，用固定了多少CO2來(lái)表征光合作用的能力。常用的參數(shù)是凈光合速率，蒸騰速率，氣孔導(dǎo)度，胞間二氧化碳濃度等。氣體交換是非常經(jīng)典的光合作用測(cè)量方法，光合儀是常被用來(lái)測(cè)量氣體交換的儀器。
熒光儀：葉綠素?zé)晒庠?，通過(guò)檢測(cè)光合作用光能利用過(guò)程中葉綠素?zé)晒獾漠a(chǎn)量(F)，來(lái)分析光合作用光能吸收，轉(zhuǎn)化和分配。用葉綠素?zé)晒鈪?shù)來(lái)表征不同途徑能量分配的多少。常用的參數(shù)有光系統(tǒng)的最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm), 實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率(Yield), 光化學(xué)淬滅(qP), 非光化學(xué)淬滅(NPQ), 電子傳遞速率（ETR）等。葉綠素?zé)晒夥ň哂袩o(wú)損，原位測(cè)量等優(yōu)勢(shì)，可以作為光合作用的有效探針，葉綠素?zé)晒鈨x廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和野外光合作用研究。
>> 總結(jié) <<
光合作用和蒸騰作用相伴發(fā)生，光合儀測(cè)量葉片和環(huán)境的氣體交換。交換的氣體是H2O和CO2，交換的門戶是氣孔，交換的結(jié)果是水分從葉片中蒸騰散失，CO2進(jìn)入葉片被同化。光合儀測(cè)量光合作用極易受到環(huán)境濕度，CO2濃度，光照，溫度的影響，測(cè)量過(guò)程中應(yīng)盡量保持環(huán)境條件穩(wěn)定。
光能的吸收與耗散平衡，熒光儀測(cè)量吸收光能中用于發(fā)射熒光的部分，根據(jù)模型計(jì)算轉(zhuǎn)化為光合電子傳遞和熱耗散的部分。熒光儀測(cè)量的葉綠素?zé)晒馔ǔＶ傅氖鞘覝兀?5℃）葉綠素?zé)晒?，熒光儀測(cè)量光合作用主要受光照強(qiáng)度（PAR）和溫度的影響。
—— 如何選擇或哪個(gè)更好用？——
任何一種儀器的選擇，
都要服從科研內(nèi)容對(duì)工具的需求！
舉個(gè)例子，一個(gè)種質(zhì)資源管理中心，如果要收集200個(gè)水稻品種的田間光合特性數(shù)據(jù)，可以嘗試使用熒光儀測(cè)量實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率即可，熒光儀可以在短時(shí)間內(nèi)測(cè)量大量樣品。換一個(gè)角度，如果是要評(píng)估改良的新品種和親本之間的光合差異，則建議使用光合儀來(lái)測(cè)量，畢竟固定CO2生成糖和淀粉才是作物產(chǎn)量的保證。你品，你細(xì)品！
光合儀和熒光儀可以獨(dú)立存在，但是光反應(yīng)和暗反應(yīng)不會(huì)獨(dú)立運(yùn)行。所以，兩者沒有絕對(duì)意義上的高下，因?yàn)楣夥磻?yīng)和暗反應(yīng)同樣重要。如果想全面的分析光合作用，光合儀和熒光儀都需要用到，最佳的使用方案是聯(lián)用，同步測(cè)量氣體交換和葉綠素?zé)晒狻?/span>
—— 使用光合儀和熒光儀要注意什么？——
>> 光合儀 <<
1、預(yù)熱！預(yù)熱！預(yù)熱！所有IRGA原理的光合儀都需要預(yù)熱！不同品牌的光合儀預(yù)熱時(shí)間不同，實(shí)際應(yīng)用中預(yù)熱的時(shí)間約為30-60分鐘。
2、分析器調(diào)零，調(diào)零的目的是為了消除光合儀的檢測(cè)誤差。不同品牌，不同型號(hào)的光合儀，根據(jù)IRGA類型的不同，調(diào)零模式有差異。目前比較常見的是雙通道四分析器光合儀，雙通道是Reference和Sample兩股氣路通道，四分析器分別是H2O Reference分析器和CO2 Reference分析器，H2O Sample分析器和CO2 Sample分析器。在測(cè)量葉片前先測(cè)量分析器的讀數(shù)差異并將其固定即視為調(diào)零，之后才可以進(jìn)行氣體交換的測(cè)量。
調(diào)零氣路
測(cè)量氣路
3、精確控制環(huán)境因子（光、溫、水、氣），光合儀主要采用開放式氣路系統(tǒng)，即光合儀從環(huán)境中吸取空氣，測(cè)量流經(jīng)葉片前后CO2和H2O的濃度變化，測(cè)量后的氣體從出氣口流走。環(huán)境空氣的溫度，濕度，CO2濃度及環(huán)境的光強(qiáng)劇烈波動(dòng)會(huì)嚴(yán)重影響光合儀的使用。因此建議在使用過(guò)程中精確控制環(huán)境因子。
4、原位測(cè)量，嚴(yán)禁離體，因?yàn)殡x體葉片生理狀態(tài)會(huì)發(fā)生變化，最明顯的就是氣孔關(guān)閉。除了離體損傷之外，可能會(huì)導(dǎo)致氣孔關(guān)閉的還有手上的汗液或化妝品殘留等，所以不要直接用手擦拭葉片。
5、葉片面積（或重量），光合儀計(jì)算的光合速率是單位面積（或重量），單位時(shí)間內(nèi)的CO2同化率，測(cè)量時(shí)需要已知的測(cè)量面積（或重量）?，F(xiàn)在有些品牌的光合儀允許測(cè)量完成后修正測(cè)量面積（或重量），重新計(jì)算光合速率，如德國(guó)WALZ的GFS-3000。
6、葉片溫度，葉片溫度是計(jì)算光合參數(shù)和控制氣體交換溫度的重要依據(jù)。因?yàn)楣夂蟽x的測(cè)量原理默認(rèn)葉肉細(xì)胞內(nèi)為100% 相對(duì)濕度。
7、葉室氣流流速，流經(jīng)葉室的氣流流速，與氣體交換參數(shù)計(jì)算有關(guān)。光合能力弱的陰生植物可以嘗試低流速測(cè)量。
8、日常維護(hù)，光合儀屬于精密的氣體分析儀器，為保證測(cè)量的準(zhǔn)確性，應(yīng)該定時(shí)做標(biāo)定，標(biāo)定程序分為CO2和H2O分析器零點(diǎn)標(biāo)定和CO2和H2O分析器跨度標(biāo)定。光合儀在環(huán)境因子控制過(guò)程中會(huì)消耗一些藥品，如干燥劑和堿石灰等，使用前后要注意檢查。光合儀作為野外便攜式測(cè)量設(shè)備，時(shí)常會(huì)被帶到野外去實(shí)驗(yàn)，使用中務(wù)必留意電池電量狀況，及時(shí)保存數(shù)據(jù)，使用前后及時(shí)給電池充電。特別提醒，遠(yuǎn)離水源！
>> 熒光儀 <<
1、熒光儀的種類，目前常用的葉綠素?zé)晒鈨x有兩種，脈沖調(diào)制式的和連續(xù)激發(fā)式的。脈沖調(diào)制式的可以在有環(huán)境光為背景的情況下使用，連續(xù)激發(fā)式的不可以。但是連續(xù)激發(fā)式的時(shí)間分辨率比脈沖調(diào)制式的高。脈沖調(diào)制式的葉綠素?zé)晒鈨x通常用來(lái)測(cè)量淬滅分析，快速光曲線等。連續(xù)激發(fā)式的通常用來(lái)做快相分析。
2、暗適應(yīng)，為了更好的對(duì)葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量進(jìn)行合理的解釋，如何定義光合機(jī)構(gòu)在測(cè)量開始時(shí)的狀態(tài)非常重要。所以，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論脈沖調(diào)制式還是連續(xù)激發(fā)式葉綠素?zé)晒鈨x，測(cè)量前一般需要首先進(jìn)行暗適應(yīng)。葉片的暗適應(yīng)狀態(tài)是光合機(jī)構(gòu)的基本狀態(tài)。暗適應(yīng)的方式有很多種，整株植物置于暗室，單個(gè)葉片放入暗適應(yīng)夾，夜間測(cè)量。暗適應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)短取決于我們希望從葉綠素?zé)晒庵械玫绞裁葱畔?。例如，大田作物葉片光合能力評(píng)價(jià)，暗適應(yīng)時(shí)間一般只需要30分鐘。而實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擬南芥葉片跨膜質(zhì)子梯度ΔpH的測(cè)量則需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)。
3、熒光儀光源，在熒光參數(shù)測(cè)量前對(duì)熒光儀光源有明確的認(rèn)識(shí)是非常有必要的。以調(diào)制式的葉綠素?zé)晒鈨x為例，通常會(huì)配置四種光，測(cè)量光ML，光化光AL，飽和脈沖光SP，遠(yuǎn)紅光FR。測(cè)量光，光強(qiáng)比較弱（＜1μmolm-2s-1），具有調(diào)制頻率，用于信號(hào)檢測(cè)，測(cè)量前需要調(diào)整測(cè)量光強(qiáng)度(Int.)和頻率(Freq.)使熒光信號(hào)達(dá)到基本檢測(cè)要求。測(cè)量光強(qiáng)度過(guò)高， Fm 測(cè)定時(shí)可能會(huì)因?yàn)檫^(guò)飽和被低估，如果測(cè)量光強(qiáng)度太低，則不會(huì)使用滿量程，誤差增大。光化光，是誘導(dǎo)植物發(fā)生光合作用的光，又叫作用光。常見的熒光儀光化光光源有兩種， 460nm左右的藍(lán)光或630nm左右的紅光。光化光的強(qiáng)度通常也是可以調(diào)節(jié)的，以適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需求。但是請(qǐng)注意，光源出口與樣品的距離會(huì)改變樣品表面的光強(qiáng)。所以測(cè)量前務(wù)必明確到達(dá)樣品表面的光強(qiáng)具體是多少。很多設(shè)備的出廠設(shè)置都是預(yù)設(shè)的，安裝調(diào)試時(shí)最好執(zhí)行光強(qiáng)校準(zhǔn)，確保軟件或者報(bào)告里的PAR值與樣品水品的實(shí)際光強(qiáng)值一致。飽和脈沖，脈沖調(diào)制式熒光儀除了上述兩種光還有一種飽和脈沖光，而連續(xù)激發(fā)式熒光儀通常只有飽和脈沖光。飽和脈沖在熒光儀中通常是用來(lái)計(jì)算數(shù)據(jù)的，光強(qiáng)比較強(qiáng)，一般都要大于3000μmolm-2s-1。為適應(yīng)不同樣品類型和實(shí)驗(yàn)要求，飽和脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間通常也是可以調(diào)節(jié)的。遠(yuǎn)紅光，有些品牌或型號(hào)的熒光儀還會(huì)搭載用于激發(fā)光系統(tǒng)Ⅰ的遠(yuǎn)紅光，遠(yuǎn)紅光可以用來(lái)測(cè)量Fo’，暗弛豫，狀態(tài)轉(zhuǎn)換。
4、Fv/Fm, (Fm-Fo)/Fm,最大光能轉(zhuǎn)換效率，反應(yīng)植物潛在的最大光合能力。通過(guò)測(cè)量暗適應(yīng)之后的最小熒光Fo和最大熒光Fm計(jì)算而來(lái)。該參數(shù)相對(duì)獨(dú)立，可以單獨(dú)使用，來(lái)評(píng)估脅迫條件下植物的光合特性變化或用來(lái)篩選突變體。大多數(shù)熒光儀都可以測(cè)。
5、ΦPSII，(Fm’-F)/Fm’, 實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率，反應(yīng)植物在穩(wěn)態(tài)下的實(shí)際光合能力，通過(guò)測(cè)量穩(wěn)定環(huán)境（光溫水汽）狀態(tài)下的最小熒光F和最大熒光Fm’計(jì)算而來(lái)?？梢栽谇缋实奶鞖猓焖贉y(cè)量大量植物的光合特性。測(cè)量過(guò)程要同時(shí)采集環(huán)境參數(shù)，如光強(qiáng)，溫度等。
6、誘導(dǎo)曲線，Induction Curve，慢速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)（Slow Kinetics）的一種。測(cè)量誘導(dǎo)曲線可以獲得淬滅分析（Quenching Analysis）的參數(shù)，光化學(xué)淬滅(qP), 非光化學(xué)淬滅(NPQ)。實(shí)際應(yīng)用中，誘導(dǎo)曲線后可以增加暗弛豫的測(cè)量，進(jìn)一步分析植物非光化學(xué)淬滅的能力。完整操作如下，先通過(guò)光化光誘導(dǎo)植物葉片達(dá)到穩(wěn)態(tài)，測(cè)量光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅。然后關(guān)閉光化光，打開遠(yuǎn)紅光，繼續(xù)測(cè)量，直到植物在暗處再次達(dá)到穩(wěn)態(tài)，測(cè)量暗穩(wěn)態(tài)下的熒光淬滅。謹(jǐn)記，誘導(dǎo)曲線的測(cè)量需要暗適應(yīng)。
7、光曲線，Light Curve，測(cè)量不同光強(qiáng)下的量子產(chǎn)量，計(jì)算電子傳遞速率ETR（ETR=PAR*Yield*吸光系數(shù)*0.5）。光曲線是光響應(yīng)曲線的一種表征方式，相對(duì)于光合儀測(cè)氣體交換的A/Q曲線，熒光儀測(cè)量light Curve的時(shí)間可以短得多，所以又被稱為快速光曲線(RLC)。光曲線可以擬合得到光能利用效率α，最大電子傳遞速率ETRmax，半飽和光強(qiáng)Ik，實(shí)現(xiàn)不同樣品光合特性的對(duì)比。
8、熒光成像，普通的熒光儀通常以數(shù)據(jù)報(bào)告的形式呈現(xiàn)測(cè)量結(jié)果，而熒光成像則可以將數(shù)據(jù)圖像化，直觀的展現(xiàn)樣品間的光合特性差異，極大地?cái)U(kuò)展了葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的應(yīng)用。如今，熒光成像早已經(jīng)成為光合生理研究，遺傳育種，突變體篩選，病蟲害早期檢測(cè)的常用工具。相比于普通的熒光儀，熒光成像的測(cè)量面積大，全葉片成像有助于分析葉片的橫向異質(zhì)性。熒光成像并不是面積越大越好，比面積更重要的是成像區(qū)域光場(chǎng)的均一性。均勻的廣場(chǎng)保證了葉片每一個(gè)部位的照光條件一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才更可靠。所以熒光成像的光源布局要經(jīng)過(guò)精心的的設(shè)計(jì)，就像手術(shù)臺(tái)的無(wú)影燈，照亮每一個(gè)看得見的角落。
熒光參數(shù)圖像（Belén Naranjo,etal. 2016）
再次聲明，光合作用研究?jī)x器沒有好壞之分，DIY或Custom-Made的測(cè)量系統(tǒng)照樣可以發(fā)好文章。正所謂光合儀器測(cè)量的數(shù)據(jù)千篇一律，有趣的idea萬(wàn)里挑一。再次祝各位老師，用好儀器，做好實(shí)驗(yàn)，講好故事，發(fā)好文章！
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