最近幾年，基于對綠藻和藍細菌的一些測量結果，打破了我們長期認為的光合生物體內可變熒光完全來自光系統(tǒng)II的認知范式。通過比較光誘導的Fv＞700 nm和Fv＜710 nm的變化可以用來鑒定Fv(I)。強光誘導的Fv(I)在Fv＞700 nm時比在Fv＜710 nm時約大1.5倍。近期Ulrich Schreiber教授發(fā)表在Photosynthesis Research上的新研究成果以模式綠藻小球藻(Chlorella vulgaris)為研究對象，通過比較遠紅光(720 nm，大部分被PSI吸收)和可見光(540 nm，被PSI和PSII吸收)激發(fā)的光誘導長波熒光(＞765 nm)變化，進一步擴展了該方面的工作。該研究測量了由540 nm飽和光引起的可變熒光(Fv)多相上升曲線，將初始O-I1上升相歸一化后，假定反映Fv(II)，結果顯示出720 nm激發(fā)(720 ex)的 I2-P瞬態(tài)比540 nm激發(fā)(540 ex)的高2倍的。分析Fo(I)對Fo(720 ex)和Fo(540 ex)的貢獻發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)o(I)720 ex比Fo(I)540 ex高2倍，這支持了整個I2-P瞬變是由Fv(I)引起的觀點。F(I)/F(II)的激發(fā)比從 680 nm 到 720 nm 的兩倍增加遠小于作用光譜已知的PSI/PSII 的八到十倍增加。有人認為，測得的F＞765 nm并不代表PSI的大部分葉綠素，而是反映了一小部分具有吸收遠紅光特性的葉綠素形式(“red Chls”)。另外，基于相同的方法，即比較用720 ex和540 ex測量的多相上升曲線，F(xiàn)v(I)也被證實普遍存在于其他各種光合生物中，如藍細菌、苔蘚、蕨類植物、高等植物葉片。
上述研究結果是由德國伍茲堡大學教授Ulrich Schreiber使用多激發(fā)波長調制葉綠素熒光儀Multi-Color-PAM和雙通道葉綠素熒光儀DUAL-PAM-100組合的測量系統(tǒng)做出的。文章于2023年1月4日發(fā)表在光合作用專業(yè)期刊Photosynthesis Research上，標題為“Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo”。在本研究中Multi-Color-PAM充分發(fā)揮了它出色靈敏度與卓越時間分辨率(10 μs)相結合的特點，同時它還具有多個波長的激發(fā)光，非常適合于研究光系統(tǒng)捕光天線尺寸，反應中心關閉和開放，以及類胡蘿卜素自由基參與進行的快速高光強淬滅(HIQ)。
2021年初Ulrich Schreiber教授曾在Photosynthesis Research上發(fā)表過一篇題為Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo的文章。研究了綠色單細胞藻類小球藻、藍藻聚球藻和淡綠色常春藤葉片，呈現(xiàn)的結果為體內存在可變PS I熒光Fv(I)提供了強有力的證據(jù)。這次通過測量遠紅光激發(fā)誘導葉綠素熒光的變化無疑為活體內存在光系統(tǒng)I可變熒光進一步提供了新的證據(jù)。(往期推文：科學家發(fā)現(xiàn)活體中光系統(tǒng)I存在可變葉綠素熒光的證據(jù))
使用遠紅光(FR，優(yōu)選720 nm)或可見光(優(yōu)選540 nm)脈沖調制激發(fā)檢測單元比較測量光誘導葉綠素熒光產量變化的實驗裝置框架圖。光學單元的幾何形狀針對兩種類型的測量光(ML)以及540 nm光化光(AL)和多周轉閃光 (MT)的均勻照明進行了優(yōu)化。脈沖調制熒光的相對產率是用由PamWin-3軟件控制的Multi-Color-PAM熒光儀測量的。定制的540 nm LED陣列由DUAL-PAM-100的控制單元(DUAL-C)供電，并通過從MC-PAM獲得的預編程觸發(fā)信號進行控制。
使用720 nm(紅線，720ex)和540 nm(藍線，540ex)脈沖調制測量光測量暗適應的小球藻懸浮液得到的多相熒光上升曲線。熒光從I1-P的相變，720ex大于540ex。在MT誘導過程中，兩個信號之間的差異在2 ms內保持在675 mV，然后在上升到P點期間增加到755 mV。由于720ex的PSI/PSII激發(fā)比毋庸置疑的高于540ex，這意味著上升P點的部分熒光必須來自PSI，因此反映了Fv(I)。
使用720 nm脈沖調制激發(fā)測量的多相熒光上升曲線，將Fo反卷積為Fo(I)和Fo(II)的貢獻。Fo(540ex)由35%Fo(I)和65%Fo(II)組成，F(xiàn)o(720ex)由52%Fo(I)和48%Fo(II)組成。540ex的Fo(I)/Fo(II) = 35/65 = 0.539，而720ex的為52/48 = 1.083。因此，720ex的Fo(I)/Fo(II)比率恰好比540ex大2倍。因此，F(xiàn)v(I)/Fv(II)的比率也應比720ex比540ex高2倍。
暗適應后(PQ庫部分還原)小球藻全部Fv(720ex)多相上升動力學的Fv(I)和Fv(II)組分的反卷積。
在弱FR背景光(PQ庫預氧化)存在下，全部Fv(720ex)動力學的Fv(I)和Fv(II)分量的反卷積。
小球藻540ex和680ex(圖a)，700ex(圖b)，720ex(圖c)的多相上升動力學。680 nm以上的激發(fā)波長下顯示出“額外的Fv(I)”。
小球藻中“額外Fv(I)”的信息源自使用540ex 和紅光-光紅光光譜范圍內的各種激發(fā)波長對多相上升動力學的比較測量。a: “額外Fv(I)”的動力學。b “額外Fv(I)”的振幅與紅光-光紅光激發(fā)波長的函數(shù)?！邦~外的Fv(I)”被縮放為O-I1振幅的分數(shù)。
使用720ex(紅線)和540ex(綠線)測量的 3 種不同強度的540 nm光化照明開始時的暗-光熒光誘導動力學曲線探究Fv(I)對光化強度的依賴性。
0.1 μM DCMU(a)和1 μM DCMU(b)對用720ex和540ex測量的多相上升動力學曲線的影響。
不同光合生物各自720ex和540ex 測量的Fv值之間的差異。這些結果只是為了證明光合生物中“額外Fv(I)”現(xiàn)象的普遍性。截至目前，強光化光引起熒光產率的多相上升動力學幾乎完全根據(jù)Fv(II)來解釋。雖然人們普遍認為“光化學”O(jiān)-I1(或O-J)相反映了PSII反應中心關閉時的Fv(II)，但“熱”I1-I2-P(或J-I-P)相對此則給出了完全不同的解釋。隨著研究人員的新證據(jù)證明I2-P相反映了小球藻中的Fv(I)，我們必須重新考慮以前對多相上升動力學這部分的解釋。至于前面的I1-I2階段，新的文章以及Schreiber和Klughammer 2021的文章中提供的數(shù)據(jù)清楚地表明它反映了Fv(II)，這就提出了I1相對于I2 的淬火性質問題。文獻中討論了涉及PSⅡ受體和供體側、氧化的PQ以及PSII 反應中心水平的“構象”變化的許多機制。一個關鍵觀察結果是DCMU消除了這種猝滅。支持Schansker 等人的早期結論?；?PSII 構象變化的淬火機制受到Magyar 等人的青睞。他們基于的結果是在DCMU存在的情況下對閃光引起的熒光上升的測量。在這些研究中，在飽和的1.5 μs閃光后達到中間熒光產率 F1，并且只有大量這樣的閃光才能達到最大熒光產率 Fm。從 F1 到 Fm 的轉變被認為反映了光化學誘導的蛋白質構象變化，這種變化在體內“對大部分Fv 負責”。鑒于本研究的結果，這種 Fv 對從 Fo 到 Fm(或 P)的整體增加的貢獻似乎僅適用于 I1-I2階段。然而，這不僅可以通過 DCMU 消除，而且還可以通過在黑暗中預還原 PQ 池來很大程度上抑制。前面得一幅圖中，P、I1和“額外Fv(I)”的振幅分別為1.63、1.00 和 0.31。假設在小球藻中 Fv(I) = 2ד額外的 Fv(I)”幾乎沒有 I1-I2可能與 Fv 由于光驅動的構象變化有關。然而，不能排除當PQ庫在黑暗中還原時會引起構象變化。任何進一步嘗試回答I1和 I1-I2相淬火的起源都超出了本通訊的范圍。在實際應用中，飽和脈沖猝滅分析具有特殊的價值，因為它可以評估樣品在給定光照狀態(tài)下的光合狀態(tài)。在這些條件下，F(xiàn)d下游的反應被光激活，F(xiàn)v(I)的干擾被最小化。然而，當在暗適應后測量最大Fv/Fm時，需要特別注意，其中Fv和Fm的值包含大量的I2-P分量，因此也包含大量的Fv(I)。這個問題可以通過適應低強度背景照明來代替嚴格的暗適應來避免。預光照應激活 Fd下游的反應，而不會引起顯著的能量依賴性非光化學猝滅NPQ。由此產生的 I2-P抑制不可避免地導致較低的Fv/Fm值。另一方面，當修正F(I)對Fo的貢獻時，會獲得更高的Fv/Fm值。當忽略Fv(I)的存在時，這可能會導致對光誘導熒光變化的誤解。例如，非光化學猝滅(NPQ)通常參考暗適應后測量的 Fm 狀態(tài)進行量化。當在中等光強度下照射時，最大熒光產量Fm'相對于Fm下降，這正式導致NPQ增加，而實際上Fm'的下降是由于光激活抑制I2-P相 PSI下游的反應。在NPQ的定量研究中應考慮到這一方面，方法是將暗適應后的 I2水平而不是Fm水平作為參考。為什么Fv(I)沒有更早被發(fā)現(xiàn)？90多年前，當Hans Kautsky發(fā)現(xiàn)可變Chl熒光時，當時還沒有關于存在兩個光系統(tǒng)的信息。此類信息在30年后逐漸出現(xiàn)，Chl熒光被證明是闡明PSII中水的分裂與PSI受體側NADP還原之間的各種電子傳輸步驟的先驅工具。雖然很明顯部分熒光源自PSI，但人們認為這是恒定的，僅對暗熒光Fo 有貢獻。我們現(xiàn)在知道，與Fv(II)相比，F(xiàn)v(I)的振幅確實很小。此外，F(xiàn)v(I) 僅在相對較短的時間窗口(20到200毫秒)內用飽和光照射時瞬態(tài)發(fā)展。最后但同樣重要的是，F(xiàn)v(I)在連續(xù)光照和DCMU 存在下被抑制。雖然DCMU通過阻斷二次電子傳輸在PSII初級反應的研究中非常有價值，但PSI不存在類似的抑制劑。據(jù)推測，這是迄今為止Fv(I)尚未被強大的時間分辨熒光測量技術檢測到的主要原因，在過去的30年中，該技術已應用于許多研究兩個光系統(tǒng)吸收的激發(fā)能的命運 。原理上，衰變相關光譜(DAS)允許對體內Chl熒光的特性進行詳細和準確的分析。PSI和PSII熒光的貢獻可以很容易地根據(jù)它們截然不同的壽命和衰變相關的激發(fā)和發(fā)射光譜來區(qū)分。然而，當作為檢測Fv(II)的常規(guī)做法添加PSII抑制劑DCMU時，F(xiàn)v(I)被有效阻止。當PSI下游的反應被預光照光激活時，F(xiàn)v(I)的誘導也會被阻止。暗適應后，必須應用非常強的多次周轉光脈沖以確保 PSI(鐵氧還蛋白)受體側的限制關閉，然后通過光激活再次打開，這在藻類和藍藻中特別快。另一方面，由于可以預期Fv(I) 的壽命比 Fo(I) 的壽命長得多，并且相對于Fv(II) 應該有相當大的紅移，因此可以通過時間確認其存在。當滿足上述要求時，分辨測量應該不會太困難。1、Multi-Color- PAM 熒光儀被擴展用于使用 FR 脈沖調制測量光測量暗光 Chl 熒光誘導動力學。2、使用該測量系統(tǒng)，首次在波長> 765 nm處測量了PSI熒光激發(fā)F(I)的多相上升動力學。3、對原始720ex 信號中包含的相對較大的恒定背景信號進行量化和校正，因此不僅可以獲取有關Fv(I) 的定量信息，還可以獲得有關 Fo(I) 的定量信息。4、按照 Schreiber 和Klughammer (2021) 介紹的方法，重新調整 720ex 和540ex 響應，使其 O-I1振幅相等，因此所有F(II) 響應均等。5、從O-I1均衡Fv(720ex)和Fv(540ex) 響應之間的差異，推導出選擇性Fv(I)響應，對應于720ex 與 540ex相比觀察到的“額外Fv(I)”。6、分析Fo(I)和Fo(II)對Fo(720ex)和Fo(540ex)的貢獻表明，在暗適應的小球藻中，720ex的Fo(I)/Fo(II)比值比540ex高兩倍，假設Fo(I)/Fo(II) = 35/65與540ex 的合理比率。7、假設Fv(I)/Fv(II)與720ex的比率超過540ex的2倍，推斷在暗適應的小球藻中，F(xiàn)v(720ex)中包含的Fv(I)總計2倍“額外的Fv(I)”。8、基于此Fv(I)信息，對Fv(II)動力學進行了解卷積，它與原始Fv(720ex)動力學非常匹配，直至約20 ms，F(xiàn)v(I) 開始發(fā)展。此后，F(xiàn)v(II)開始飽和，而Fv(I)在約200 ms時顯示瞬態(tài)峰值。數(shù)據(jù)支持 I2-P(或 I-P)階段歸因于Fv(I) 的觀點。9、正如在小球藻中，取決于實驗條件，不能始終區(qū)分不同的 I2階躍或拐點，I2水平被定義為P和I2水平之間的差異等于Fv(I)振幅，即測量的“額外Fv(I)?！?/span>10、在較低光化強度下使用720ex和540ex進行的暗光感應動力學比較測量表明，當無法區(qū)分I1和I2水平時，一些Fv(I) 也隱藏在“經典”考茨基效應(O-I-P-S 瞬態(tài))的峰值中。11、發(fā)現(xiàn) DCMU 可以“從上方”抑制I2-P相位，這與最大 F(II) 由I2而不是 P(或 Fm)指示的結論一致。12、使用540ex 和680-740 nm范圍內的各種激發(fā)波長的比較測量表明，“額外的 Fv(I)”在波長?> 680 nm 時產生，并在約720 nm 處達到峰值。13、雖然Fv(I)在“紅降”光譜范圍內的發(fā)展定性地與眾所周知的PSI/PSII激發(fā)從PSI和PSII 作用光譜中增加一致，但觀察到F(I)/F(II)激發(fā)比率的2倍系數(shù)和有效PSI/PSII 活性的8-10 倍系數(shù)存在明顯差異。提出了“紅色 Chls”在確定在波長?> 765 nm 時測量的F(I) 和 F(II) 特性中的可能作用。14、重新審視了Schreiber 和 Klughammer (2021)中的F > 700與F < 710數(shù)據(jù)，其中F < 710 響應中相對較大的I2-P振幅似乎反映了“太多”F(I) < 710。精細分析 這些數(shù)據(jù)顯示Fo(I) > 700/Fo(I) < 710 = Fv(I)?> 700/Fv(I) < 710 = 1.48，當激發(fā)比F(I)/F(II) = 假設F < 710 為 35/65。得出結論，活體內F < 710確實包含比通常假設更多的F(I)，這與過去10年許多實驗室發(fā)表的報告一致，即LHCII是PSI天線系統(tǒng)的組成部分。15、使用 720ex 和540ex 對各種不同的光合生物進行的比較測量表明，所有這些生物中都有大量“額外的Fv(I)”。在藍藻中發(fā)現(xiàn)了一個特別大的“額外 Fv(I)”(幾乎與 O-I1相一樣大)，因此似乎特別適合在體內進一步研究Fv(I)。—— 參考文獻 ——
1、Schreiber, U. Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res (2023).
2、Schreiber, U., Klughammer, C. Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res 149, 213–231 (2021).
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