玉米是世界上最重要的作物之一，是重要的糧、經(jīng)、飼兼用作物。玉米小斑?。⊿LB）、大斑?。∟LB）和莖腐?。‵SR）等病害給玉米產(chǎn)量造成了巨大的損失。鑒定抗性基因和培育具有多種病害抗性（MDR）的遺傳材料是控制病害和減少產(chǎn)量損失的最有效方法。然而，目前已發(fā)現(xiàn)的具有MDR的抗性基因非常有限。已有研究證明使用CRISPR/Cas9工具編輯感?。⊿）基因（例如Mlo和MDR6）產(chǎn)生的基因組編輯材料是賦予重要經(jīng)濟(jì)作物抗病性的有效方法。對(duì)于植物抗性育種，挖掘和克隆新的感?。⊿）基因迫在眉睫。
在多種植物中，煙堿酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶1（NANMT1）是煙堿酸轉(zhuǎn)化為葫蘆巴堿（也被稱為N-甲基煙堿酸）的關(guān)鍵酶。山東大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與NLR (Nucleotide-binding，leucine rich repeat) 蛋白R(shí)p1-D21在煙草系統(tǒng)中瞬時(shí)共表達(dá)時(shí)，玉米ZmNANMT能夠抑制NLR介導(dǎo)的超敏反應(yīng)（HR）。攜帶雜合體Rp1-D21的玉米品系表現(xiàn)出自激活免疫的表型，包括生長(zhǎng)遲緩和無病原菌侵染的HR病點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZmNANMT是否能抑制玉米中Rp1-D21介導(dǎo)的HR，研究團(tuán)隊(duì)前期通過pXG071載體構(gòu)建了ZmNANMT過表達(dá)玉米株系。由于DsRed2熒光標(biāo)記在糊粉層中特異表達(dá)，通過眼睛觀察即可區(qū)分陽性和陰性的轉(zhuǎn)基因種子。
近日，山東大學(xué)的該研究團(tuán)隊(duì)在以前的研究基礎(chǔ)之上在《Plant Biotechnology Journal》在線發(fā)表了題為“Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize”的研究論文，介紹了研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)玉米中一個(gè)新的感病基因ZmNANMT，通過基因編輯ZmNANMT提高了玉米對(duì)多種病害的廣譜抗性，并且不影響玉米其他重要農(nóng)藝性狀。
研究團(tuán)隊(duì)從15個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系中，獲得了3個(gè)純合基因型的ZmNANMT過表達(dá)的T3株系（OE-3、OE-4和OE-11），以及與其對(duì)應(yīng)的陰性同胞株系（Neg-3、Neg-4和Neg-11），其蛋白質(zhì)印跡（western blot）結(jié)果如圖1a所示。研究團(tuán)隊(duì)將OE-3和Neg-3雜交獲得含有雜合Rp1-D21的F1株系，F(xiàn)1植株顯示出Rp1-D21蛋白1:1的分離比，包括OE-3×Rp1-D21、OE-3×no Rp1-D21、Neg-3×Rp1-D21和Neg-3×no Rp1-D21單株。在田間V6生長(zhǎng)階段，Neg-3×Rp1-D21植株在第6和第7片葉顯現(xiàn)出非常明顯的HR病斑（圖2a&b）。而與陰性對(duì)照相比，OE-3×Rp1-D21植株的HR病斑則表現(xiàn)較弱（圖2a&b）。在抽穗期，OE-3×Rp1-D21的植株明顯高于其陰性對(duì)照Neg-3×Rp1-D21植株（圖2c）。這些結(jié)果表明，ZmNANMT在玉米中NLR蛋白R(shí)p1-D21介導(dǎo)的HR中起負(fù)調(diào)控作用，且過量表達(dá)ZmNANMT可以部分克服Rp1-D21介導(dǎo)的自激活免疫表型。
圖1 過表達(dá)株系的蛋白檢測(cè)和三個(gè)CRISPR/Cas9株系ZmNANMT的序列
為了確定ZmNANMT基因在玉米抗病中的作用，研究團(tuán)隊(duì)鑒定了ZmNANMT過表達(dá)株系的玉米主要病害表型，這些病害包括小斑?。⊿LB）、大斑病（NLB）和莖腐?。‵SR）。結(jié)果顯示，在田間條件下OE-3、OE-4和OE-11植株對(duì)SLB、NLB和FSR的感病性高于其對(duì)應(yīng)的野生型同胞植株（圖2d-f）。這表明ZmNANMT是一個(gè)玉米多種病害的的感病基因。
圖2 ZmNANMT在玉米防御反應(yīng)中起著負(fù)面作用，對(duì)其進(jìn)行基因組編輯可賦予玉米多種病害抗性且不產(chǎn)生其他農(nóng)藝性狀缺陷
為了探明對(duì)ZmNANMT進(jìn)行基因組編輯能否增強(qiáng)MDR，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了兩個(gè)單鏈向?qū)NA（sgRNA1和sgRNA2），利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來靶標(biāo)ZmNANMT（圖1b）。從12個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因事件中篩選到3個(gè)純合子基因編輯株系：CR-6（sgRNA1和sgRNA2都有1bp的插入）、CR-8（sgRNA1有1 bp插入）和CR-10（sgRNA1附近有31bp的缺失）（圖1b）。所有這三個(gè)基因編輯株系都是不含Cas9的，且有預(yù)測(cè)的開放讀碼框偏移（圖1c）。通過調(diào)查在不同條件下T2或T3植株對(duì)不同病害的反應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CR株系對(duì)FSR、SLB和NLB的抗性分別明顯高于與其對(duì)應(yīng)的野生型同胞株系（圖2g-i）。
圖3 ZmNANMT的過表達(dá)植株的農(nóng)藝性狀
為了確定ZmNANMT是否對(duì)玉米的主要農(nóng)藝性狀有任何負(fù)面影響，研究團(tuán)隊(duì)在田間種植了OE株系和CR株系2年。表型鑒定結(jié)果顯示，OE株系和基因編輯株系在果穗大小和其他農(nóng)藝性狀方面與對(duì)應(yīng)的野生型同胞對(duì)照沒有顯著差異(圖2j&k、圖3和圖4）。
圖4 ZmNANMT基因CRISPR/Cas9編輯株系的農(nóng)藝性狀
綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了ZmNANMT是一個(gè)新型植物感病基因，通過基因編輯能夠增強(qiáng)玉米對(duì)多種病害的廣譜抗性并且不影響玉米的產(chǎn)量。NANMT可以將煙酸轉(zhuǎn)化為葫蘆巴堿，其功能在不同植物物種中是保守的，CR植株的MDR的增加可能是由NA的積累引起的，NA可以增加植物的抗病性。本研究為培育優(yōu)良多抗品種提供了新的基因資源。
—— 參考文獻(xiàn) ——
Li Y J, Gu J M, Ma S, et al. Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize[J]. Plant Biotechnology Journal, 2023.
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